傳染性造血器官壞死病毒IHNV熒光PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)
【產(chǎn)品名稱(chēng)】
商品名稱(chēng):傳染性造血器官壞死病毒(IHNV)核酸檢測(cè)試劑盒(RT-PCR 熒光探針?lè)?
Name :Diagnostic Kit for Infectious hematopoietic necrosis virus RNA (RT-PCR Fluorescence Probing)
【包裝規(guī)格】48份/盒
【預(yù)期用途】
本試劑盒適用于檢測(cè)的魚(yú)的腦、肝、腎、脾、腮等組織、雌魚(yú)的卵巢液等標(biāo)本
中傳染性造血器官壞死病毒 RNA,適用于傳染性造血器官壞死病毒感染的輔助診斷。
其檢測(cè)結(jié)果僅供參考。
【檢驗(yàn)原理】
本試劑盒用一對(duì)傳染性造血器官壞死病毒特異性引物,結(jié)合一條特異性熒光探
針,用一步法熒光 RT-PCR 技術(shù)對(duì)傳染性造血器官壞死病毒 RNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增檢
測(cè),用于臨床上對(duì)可疑感染者的病原學(xué)診斷。
【試劑組成】
名 稱(chēng) 規(guī) 格
酶液 50μl×1 管
IHNV 反應(yīng)液 1.0ml×1 管
IHNV 陽(yáng)性質(zhì)控品 50μl ×1 管
陰性質(zhì)控品 250μl ×1 管
說(shuō)明:不同批號(hào)的試劑盒組分不可交互使用。
【儲(chǔ)存條件及有效期】
-20℃±5℃,避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融少于 5 次,
有效期 12 個(gè)月。
【適用儀器】
ABI 7300、7500、ABI stepone / stepone plus 、安捷倫 MX3000P/3005P、MJ
Opticon2 等其他熒光定量 PCR 檢測(cè)儀。
【標(biāo)本采集】
對(duì)于有臨床癥狀的魚(yú),如體長(zhǎng)不大于 4cm,取整條魚(yú),體長(zhǎng) 4~6cm 的魚(yú),取內(nèi)
臟(包括腎);體長(zhǎng)大于 6cm 的魚(yú)則取腦、肝、腎、脾;對(duì)于無(wú)癥狀的魚(yú),取腎、脾、
腮和腦組織,成熟雌魚(yú)還需取卵巢液。
【保存和運(yùn)輸】
上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃,長(zhǎng)期保存可置-70℃,但不能超過(guò) 6 個(gè)月,標(biāo)
本運(yùn)送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運(yùn)輸,嚴(yán)禁反復(fù)凍融。
【使用方法】
1. 樣品處理(樣本處理區(qū))
1.1樣本前處理
每份組織分別從 3 個(gè)不同的位置稱(chēng)取樣品約 1g,手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.05g 于
研磨器中研磨,加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨,待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管
中,8000rpm 離心 2min,取上清液 100uL 于 1.5mL 滅菌離心管中;卵巢液直接取
100uL。
1.2RNA 提取
推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的 RNA 提取試劑盒(離心柱提取
法),請(qǐng)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。
2. 試劑配制(試劑準(zhǔn)備區(qū))
根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù),設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性
對(duì)照+1 管陽(yáng)性對(duì)照;樣品每滿 7 份,多配制 1 份),每測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表:
試劑 IHNV 反應(yīng)液 酶液
用量 20μl 1μl
3. 加樣(樣本處理區(qū))
將步驟 1 提取的 RNA、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μl,分別加入相應(yīng)的反
應(yīng)管中,蓋好管蓋,混勻,短暫離心。
4. PCR 擴(kuò)增(核酸擴(kuò)增區(qū))
4.1將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi);
4.2設(shè)置好通道、樣品信息,反應(yīng)體系設(shè)置為 25ul;熒光通道選擇:
檢測(cè)通道(Reporter Dye)FAM, 淬滅通道(Quencher Dye)NONE,請(qǐng)勿
選擇 ROX 參比熒光。
4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置:
步驟 循環(huán)數(shù) 溫度 時(shí)間 收集熒光信號(hào)
1 1cycle 42℃ 20min 否
2 1 cycle 95℃ 10min 否
3 40 cycle
94℃ 15sec 否
55℃ 30sec 是
5. 結(jié)果分析判定
5.1結(jié)果分析條件設(shè)定
設(shè)置 Baseline 和 Threshold:一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析,當(dāng)曲
線出現(xiàn)整體傾斜時(shí),根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15
范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),以及 Threshold 的 Value
值(上下拖動(dòng)閾值線至高于陰性對(duì)照),重新分析結(jié)果。
5.2結(jié)果判斷
陽(yáng)性:檢測(cè)通道 Ct 值≤35.0,且曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)曲線;
可疑:檢測(cè)通道 35.0<Ct 值≤37,建議重復(fù)檢測(cè),如果檢測(cè)通道仍為 35.0<Ct
值≤37,且曲線有明顯的增長(zhǎng)曲線,判定為陽(yáng)性,否則為陰性;
陰性:樣本檢測(cè)結(jié)果 Ct 值>37 或無(wú) Ct 值。
6. 檢測(cè)方法的局限性
Ø 樣本檢測(cè)結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān);
Ø 樣本提取過(guò)程中沒(méi)有控制好交叉污染,會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果;
Ø 陽(yáng)性對(duì)照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏,會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果;
Ø 病原體在流行過(guò)程中基因突變、重組,會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果;
Ø 不同的提取方法存在提取效率差異,會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果;
Ø 試劑運(yùn)輸,保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測(cè)效能下降,出現(xiàn)假陰性或
定量檢測(cè)不準(zhǔn)確的結(jié)果;
Ø 本檢測(cè)結(jié)果僅供參考,如須確診請(qǐng)結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測(cè)手段。
7. 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
陰性質(zhì)控品:無(wú)明顯擴(kuò)增曲線或無(wú) Ct 值顯示;
陽(yáng)性質(zhì)控品:擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長(zhǎng)期,且 Ct 值≤32;
以上條件應(yīng)同時(shí)滿足,否則實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。
8. 產(chǎn)品性能指標(biāo)
陰陽(yáng)性參考品符合率:5 份陽(yáng)性參考品符合率為 100%;10 份陰性參考品符合率
為 100%。
低檢測(cè)限:5.0×102copies/ml。
精密度:批內(nèi)、批間精密度檢測(cè) Ct 值的變異系數(shù)(CV)均小于等于 3%。
【注意事項(xiàng)】
Ø 所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行;
Ø 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化,*混勻并短暫離心;
Ø 反應(yīng)液應(yīng)避光保存;
Ø 反應(yīng)中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊;
Ø 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)工作服;
Ø 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行,以免交叉污染;
Ø 實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器;
Ø 試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待,并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全
通則》進(jìn)行處理。
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