腸道病毒通用型(EV-U)熒光PCR檢測試劑盒說明書
【產(chǎn)品名稱】
商品名稱:腸道病毒通用型(EV-U)核酸檢測試劑盒(RT-PCR 熒光探針法)
Name :Diagnostic Kit for Enterovirus RNA (RT-PCR Fluorescence Probing)
【包裝規(guī)格】48 份/盒
【預期用途】
本試劑盒適用于檢測的糞便或腹瀉物等標本中腸道病毒通用型 RNA,適用于腸
道病毒通用型感染的輔助診斷。其檢測結(jié)果僅供參考。
【檢驗原理】
本試劑盒用一對腸道病毒通用型特異性引物,結(jié)合一條特異性熒光探針,用一
步法熒光 RT-PCR 技術(shù)對腸道病毒通用型 RNA 進行體外擴增檢測,用于臨床上對
可疑感染者的病原學診斷。
【試劑組成】
名 稱 規(guī) 格
酶液 50μl×1 管
EV-U 反應液 1.0ml×1 管
EV-U 陽性質(zhì)控品 50μl ×1 管
陰性質(zhì)控品 250μl ×1 管
說明:不同批號的試劑盒組分不可交互使用。
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃,避光保存、運輸、反復凍融少于 5 次,
有效期 12 個月。
【適用儀器】
ABI 7300、7500、ABI stepone / stepone plus 、安捷倫 MX3000P/3005P、MJ
Opticon2 等其他熒光定量 PCR 檢測儀。
【標本采集】
取糞便或腹瀉物置入無菌玻璃管中,用無菌棉球?qū)⒃嚬苋o后,密閉送檢。
【保存和運輸】
上述標本短期內(nèi)可保存于-20℃,長期保存可置-70℃,但不能超過 6 個月,標
本運送應采用 2~8℃冰袋運輸,嚴禁反復凍融。
【使用方法】
1. 樣品處理(樣本處理區(qū))
1.1樣本前處理
取黃豆顆粒大小糞便或 100uL 水樣腹物置于 1.5mL 離心管中,按 RNA 提取試劑
盒說明書進行提取。
1.2RNA 提取
推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的 RNA 提取試劑盒(離心柱提取
法),請按照試劑盒說明書進行操作。
2. 試劑配制(試劑準備區(qū))
根據(jù)待檢測樣本總數(shù),設所需要的 PCR 反應管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性
對照+1 管陽性對照;樣品每滿 7 份,多配制 1 份),每測試反應體系配制如下表:
試劑 EV-U 反應液 酶液
用量 20μl 1μl
3. 加樣(樣本處理區(qū))
將步驟 1 提取的 RNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μl,分別加入相應的反
應管中,蓋好管蓋,混勻,短暫離心。
4. PCR 擴增(核酸擴增區(qū))
4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內(nèi);
4.2設置好通道、樣品信息,反應體系設置為 25ul;熒光通道選擇:
檢測通道(Reporter Dye)FAM, 淬滅通道(Quencher Dye)NONE,請勿
選擇 ROX 參比熒光。
4.3推薦循環(huán)參數(shù)設置:
步驟 循環(huán)數(shù) 溫度 時間 收集熒光信號
1 1cycle 42℃ 20min 否
2 1 cycle 95℃ 10min 否
3 40 cycle
94℃ 15sec 否
55℃ 30sec 是
5. 結(jié)果分析判定
5.1結(jié)果分析條件設定
設置 Baseline 和 Threshold:一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析,當曲
線出現(xiàn)整體傾斜時,根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15
范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),以及 Threshold 的 Value
值(上下拖動閾值線至高于陰性對照),重新分析結(jié)果。
5.2結(jié)果判斷
陽性:檢測通道 Ct 值≤35.0,且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線;
可疑:檢測通道 35.0<Ct 值≤37,建議重復檢測,如果檢測通道仍為 35.0<Ct
值≤37,且曲線有明顯的增長曲線,判定為陽性,否則為陰性;
陰性:樣本檢測結(jié)果 Ct 值>37 或無 Ct 值。
6. 檢測方法的局限性
Ø 樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān);
Ø 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,會出現(xiàn)假陽性結(jié)果;
Ø 陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏,會導致假陽性結(jié)果;
Ø 病原體在流行過程中基因突變、重組,會導致假陰性結(jié)果;
Ø 不同的提取方法存在提取效率差異,會導致假陰性結(jié)果;
Ø 試劑運輸,保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降,出現(xiàn)假陰性或
定量檢測不準確的結(jié)果;
Ø 本檢測結(jié)果僅供參考,如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。
7. 質(zhì)控標準
陰性質(zhì)控品:無明顯擴增曲線或無 Ct 值顯示;
陽性質(zhì)控品:擴增曲線有明顯指數(shù)生長期,且 Ct 值≤32;
以上條件應同時滿足,否則實驗視為無效。
8. 產(chǎn)品性能指標
陰陽性參考品符合率:5 份陽性參考品符合率為 100%;10 份陰性參考品符合率
為 100%。
低檢測限:5.0×102copies/ml。
精密度:批內(nèi)、批間精密度檢測 Ct 值的變異系數(shù)(CV)均小于等于 3%。
【注意事項】
Ø 所有操作嚴格按照說明書進行;
Ø 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應自然融化,*混勻并短暫離心;
Ø 反應液應避光保存;
Ø 反應中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊;
Ø 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)工作服;
Ø 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行,以免交叉污染;
Ø 實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器;
Ø 試劑盒里所有物品應視為污染物對待,并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全
通則》進行處理。
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