伏馬毒素快速檢測試劑盒（ELISA法）

使用說明書

（酶聯(lián)免疫法）

 1 原理及用途

伏馬毒素(Fumonisins)是由串珠鐮刀菌產(chǎn)生的真菌毒素，目前已知有28種衍生物，其中以伏馬毒素B1（FB1）為普遍，研究也為深入，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)玉米及其制品，如動物飼料均易被FB1造成污染。FB1毒性在伏馬毒素，對多種動物有較嚴重的毒理作用。研究表明FB1可引發(fā)馬的白腦軟化癥，豬的肺水腫綜合癥，此外，還可誘發(fā)人類的食道癌和肝癌、胃癌等疾病，對畜牧業(yè)和人類的健康構(gòu)成危害。

試劑盒由預包被偶聯(lián)抗原的酶標板、辣根酶標記物、抗體、標準品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標準品或樣品溶液，樣本中的伏馬毒素B1和酶標板上預包被偶聯(lián)抗原競爭抗伏馬毒素B1抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含伏馬毒素B1含量成負相關(guān)，與標準曲線比較乘以樣本稀釋倍數(shù)即可得出樣本中伏馬毒素B1的殘留量。

2 技術(shù)指標

2.1 試劑盒靈敏度：0.5ppb(ng/ml)

2.2 反應模式：25℃，30min～15min

2.3 檢測下限：

玉米、飼料…………………………50ppb

食用油………………………………10ppb

2.4 交叉反應率：

伏馬毒素B1…………………………100%

 2.5 樣本回收率：

飼料…………………………………95±15%

玉米…………………………………100±15%

食用油………………………………85±15%

3 試劑盒組成

酶標板…………………………………96孔

標準液（黑蓋）：各1ml

0ppb、0.5ppb、1.5 ppb、4.5ppb、13.5ppb、40.5ppb

酶標記物（紅蓋）……………………5.5ml

抗體工作液（藍蓋）…………………5.5ml

底物液A（白蓋）……………………6ml

底物液B（黑蓋）……………………6ml

終止液（黃蓋）………………………6ml

10×濃縮復溶液（黃蓋）……………50ml

20×濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml

說明書…………………………………1份

4 需要的器材和試劑

4.1 儀器：酶標儀、打印機、均質(zhì)器 、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl

4.3 試劑：甲醇

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知：

實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

5.2 配液：

配液1：樣本提取液

70%甲醇，即V甲醇:V去離子水=7：3。

配液2：復溶液

將10×濃縮復溶液用去離子水10倍稀釋（1份10×濃縮復溶液加9份去離子水），復溶液在4℃環(huán)境可保存一個月。

配液3：1×工作洗滌液

將濃縮洗滌液20倍稀釋(1份洗滌液加19份去離子水)。

5.3 樣本前處理步驟：

5.3.1 玉米、飼料處理方法

1）稱取1g粉碎樣品于50ml離心管中，加5ml樣品提取液，振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；

2）取上清0.1ml，加入1.9ml復溶液，振蕩2分鐘；

3）取50μl進行分析。

樣本稀釋倍數(shù)：100   檢測下限：50ppb

（若樣本中伏馬毒素B1的含量較高，可在步驟2）按比例增大稀釋倍數(shù)，檢測出的含量乘以樣本實際的稀釋倍數(shù)即為樣本中的含量）

5.3.2 食用油處理方法

1）稱取5ml樣品于50ml離心管中，加8ml正己烷和5ml樣品提取液，振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；

2）去除上層液體，取100ul下層液體加入1.9ml復溶液，混勻；

3）取50μl進行分析。

樣本稀釋倍數(shù)：20      檢測下限：10ppb

6 酶聯(lián)免疫試驗步驟

    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

6.1 編    號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

6.2 加樣反應：加標準品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標記物50µl/孔，再加入50µl/孔的抗體工作液，用蓋板膜封板，輕輕振蕩5秒混勻，25℃反應30分鐘。

6.3 洗    滌：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用工作洗滌液350µl/孔充分洗滌5次，每次間隔30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6.4 顯    色：每孔加入底物液A 50µl，再加底物液B 50µl，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘（若藍色過淺，可適當延長反應時間）。

6.5 終    止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應。

6.6 測吸光值：用酶標儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應在終止反應后10分鐘內(nèi)完成。

7 結(jié)果分析

7.1 百分吸光率的計算

    標準液或樣本的百分吸光率等于標準液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以標準液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

A—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb標準溶液的平均吸光度值

7.2 標準曲線的繪制與計算

    以標準液百分吸光率為縱坐標，對應的標準液濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標，繪制標準液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實際濃度。

    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。

8 注意事項

8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導致所有標準的OD值偏低。

8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標準曲線不成線性，重復性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。

8.3 混合要均勻，洗板要*，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。

8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。

8.7 反應終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。

9 伏馬毒素快速檢測試劑盒（ELISA法）貯藏及保存期

儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。

保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。