豬細(xì)小病毒偽狂犬圓環(huán)2型三重?zé)晒釶CR試劑盒說明書
【產(chǎn)品名稱】
商品名稱:豬細(xì)小病毒/偽狂犬野毒/圓環(huán)2型三重?核酸檢測試劑盒(實(shí)時熒光-PCR 法)
英 文 名 :Porcine parvovirus / pseudorabies virus / ring 2 three heavy nucleic acid detection kit (real-time fluorescence -PCR)
【包裝規(guī)格】48T/盒
【預(yù)期用途】
豬細(xì)小病毒/偽狂犬野毒/圓環(huán)2型 流感病毒引起禽類的一種從呼吸系統(tǒng)到嚴(yán)重全身敗血癥等多種癥狀的傳染病[1]。其中豬細(xì)小病毒/偽狂犬野毒/圓環(huán)2型?,不僅可以感染禽類,也可以感染人類,特別是1999年以來,嚴(yán)重威脅了人類健康、畜牧業(yè)生產(chǎn)和畜產(chǎn)品的貿(mào)易,其公共衛(wèi)生意義已引起*的廣泛關(guān)注[4]。本試劑盒利用實(shí)時熒光PCR原理,定性、定量檢測禽流感病毒H9亞型,對豬細(xì)小病毒/偽狂犬野毒/圓環(huán)2型?引起的流感診斷有重要指導(dǎo)意義。
【檢驗(yàn)原理】
本試劑盒針對豬細(xì)小病毒/偽狂犬野毒/圓環(huán)2型基因高度保守區(qū)域設(shè)計特異性引物和探針,在反應(yīng)體系中含豬細(xì)小病毒/偽狂犬野毒/圓環(huán)2型?基因組模板的情況下,PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號。利用儀器對PCR過程中相應(yīng)通道的信號強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測和輸出,實(shí)現(xiàn)檢測結(jié)果的定性、定量分析。
【試劑組成】
名 稱 規(guī) 格
酶液 50μL×1 管
反應(yīng)液 1.0mL×1 管
陽性質(zhì)控品 50μL ×1 管
陰性質(zhì)控品 250μL ×1 管
注:
1)不同批號試劑不能混用。
2)試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標(biāo)示的檢測次數(shù)。
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃,避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過 5 次,有效期 12 個月。
【保存和運(yùn)輸】
上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃,長期保存可置-70℃,但不能超過 6 個月,標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運(yùn)輸,嚴(yán)禁反復(fù)凍融。
【使用方法】
1.樣品處理(樣本處理區(qū))
1.1樣本前處理
每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g,手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨,加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨,待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中,8000rpm 離心 2min,取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中;棉拭子直接取 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中。
1.2RNA 提取
推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的RNA 提取試劑盒(離心柱提取法),請按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。
2.試劑配制(試劑準(zhǔn)備區(qū))
根據(jù)待檢測樣本總數(shù),設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照;樣品每滿 7 份,多配制 1 份),每測試反應(yīng)體系配制如下表:
3.加樣(樣本處理區(qū))
將步驟 1 提取的 RNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL,分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中,蓋好管蓋,混勻,短暫離心。
4.PCR 擴(kuò)增(核酸擴(kuò)增區(qū))
4.1將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi);
4.2
熒光通道選擇: 檢測通道(Reporter Dye) FAM, 淬滅通道(Quencher Dye)
NONE,ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光,選擇 None 即可。
4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置:
5.結(jié)果分析判定
5.1結(jié)果分析條件設(shè)定
設(shè)置 Baseline 和 Threshold:一般直接按機(jī)器自動分析的結(jié)果分析,當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時,根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、
stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照),重新分析結(jié)果。
5.2結(jié)果判斷
陽性:檢測通道 Ct 值≤35.0,且明顯的擴(kuò)增曲線。
可疑:檢測通道 Ct 值>35.0,且出現(xiàn)明顯曲線的樣本建議重復(fù)試驗(yàn),重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果如果同樣出現(xiàn) Ct 值≤35.0 和明顯擴(kuò)增曲線則為陽性,否則為陰性。
陰性:樣本檢測結(jié)果無 Ct 值且無明顯的擴(kuò)增曲線。
6.質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
陰性質(zhì)控品:無明顯擴(kuò)增曲線且無 Ct 值顯示;
陽性質(zhì)控品:擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長期,且 Ct 值≤32; 以上條件應(yīng)同時滿足,否則實(shí)驗(yàn)視為無效。
【參考文獻(xiàn)】
[1]WEBSTER R G, BEAN W J, GORMA N O T, et al. Evolution and ecology of influenza A viruses [J] . Microbiol Rev, 1992, 56(1): 152 -179.
[2]GUO Y J, KRAUSS S, SENNE D A, et al. Characterization of the pathogenicity of members of the newly established H9N2 influenza virus lineages in Asia
[J] .Virology, 2000, 267( 2):279 -288.
[3]唐秀英, 付朝陽, 馮菊艷. H9 亞型禽流感的流行不防制[J] . 預(yù)防獸醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2000, 2( 4): 1-3.
[4]郭元吉, 李建國, 程小雯, 等. 禽 H9N2 亞型流感病毒能感染人的發(fā)現(xiàn)[J] . 中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志, 1999, 13( 2): 105-108.
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