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產(chǎn)品名稱:

多重?zé)晒馓结楶CR檢測試劑盒

產(chǎn)品型號(hào): 產(chǎn)品時(shí)間: 2023-07-05
多重?zé)晒馓结楶CR檢測試劑盒在反應(yīng)體系中含基因組模板的情況下,PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號(hào)。利用熒光定量PCR儀對(duì)PCR過程中相應(yīng)通道的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測和輸出,實(shí)現(xiàn)檢測結(jié)果的定性、定量分析。

產(chǎn)品概述

多重?zé)晒馓结楶CR檢測試劑盒說明書

【產(chǎn)品名稱】

商品名稱:禽流感病毒 H7N9 (AIV-H7N9)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR 法)

Name :Avian Influenza virus subtype H7N9 Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】48T/盒

【預(yù)期用途】

禽流感是由 A 型流感病毒所引起的禽類疾病。AIV 除了感染禽類外,部分亞型也

能夠引起人感染或發(fā)病。野生水禽是禽流感病毒的自然宿主,一般對(duì)其不致病,當(dāng)它

們傳染給其它物種時(shí)有時(shí)會(huì)造成大的發(fā)病率和死亡率。2013 年我國*報(bào)道了人感

染 H7N9 型 AIV,至 2015 年有 571 例感染,212 人死亡。H7N9 AIV 對(duì)禽類表現(xiàn)低

致病性,它引起家禽很輕微的或不引起臨床癥狀,但對(duì)人卻表現(xiàn)很高的致病性[1]。

本試劑盒適用于檢測標(biāo)本中的禽流感病毒 H7N9,適用于禽流感病毒 H7N9 感染

的輔助診斷及流行病學(xué)調(diào)查。

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒分別對(duì)禽流感病毒 H7N9 亞型的 HA 和 NA 基因設(shè)計(jì)特異性的引物和探

針[2-3],用一步法熒光 RT-PCR 技術(shù)對(duì)禽流感病毒 H7N9 RNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測,用

于臨床上對(duì)可疑感染者的病原學(xué)診斷。

【試劑組成】

名 稱 規(guī) 格

酶液 50μL×1 管

AIV-H7N9 反應(yīng)液 1.0mL×1 管

AIV-H7N9 陽性質(zhì)控品 50μL ×1 管

陰性質(zhì)控品 250μL ×1 管

注:

1)不同批號(hào)試劑不能混用。

2)試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標(biāo)示的檢測次數(shù)。

【儲(chǔ)存條件及有效期】

-20℃±5℃,避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融少于 7 次,有效期 9 個(gè)月。

【適用儀器】

ABI 系列 、安 捷倫 MX3000P/3005P 、MJ Opticon2、Eppendorf 2/4 Color Systems、Bio-RadCFX96 等熒光定量 PCR 檢測儀。

【標(biāo)本采集】

病死或撲殺禽,取喉氣管、腦、胸肌、心肌和肺等組織;待檢活禽,用棉拭子取

呼吸道分泌物或排泄物,置于 1mL 50%甘油生理鹽水中。

【保存和運(yùn)輸】

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃,長期保存可置-70℃,但不能超過 6 個(gè)月,標(biāo)本

運(yùn)送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運(yùn)輸,嚴(yán)禁反復(fù)凍融。

【使用方法】

1. 樣品處理(樣本處理區(qū))

1.1樣本前處理

每份組織分別從 3 個(gè)不同的位置稱取樣品約 1g,手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨

器中研磨,加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨,待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中,

8000rpm 離心 2min,取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中;棉拭子直接取 100

μL 提取。

1.2RNA 提取

推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的 RNA 提取試劑盒(離心柱提

取法),請(qǐng)按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2. 試劑配制(試劑準(zhǔn)備區(qū))

根據(jù)待檢測樣本總數(shù),設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)

照+1 管陽性對(duì)照;樣品每滿 7 份,多配制 1 份),每測試反應(yīng)體系配制如下表:

試劑 AIV-H7N9 反應(yīng)液 酶液

用量 20μL 1μL

將混合好的測試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中,21uL/管。

3. 加樣(樣本處理區(qū))

將步驟 1 提取的 RNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL,分別加入相應(yīng)的反

應(yīng)管中,蓋好管蓋,混勻,短暫離心。

4. PCR 擴(kuò)增(核酸擴(kuò)增區(qū))

4.1 將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi);

4.2 設(shè)置好通道、樣品信息,反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL;熒光通道選擇: 檢測通道

(Reporter Dye)FAM、CY5, 淬滅通道(Quencher Dye)選擇 NONE,ABI

系列儀器請(qǐng)勿選擇 ROX 參比熒光,選擇 None 即可。

4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置:

步驟 循環(huán)數(shù) 溫度 時(shí)間 收集熒光信號(hào)

1 1cycle 42℃ 20min 否

2 1 cycle 95℃ 10min 否

3 40 cycle 94℃ 15sec 否

55℃ 30sec 是

5. 結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置 Baseline 和 Threshold:一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析,當(dāng)曲線出現(xiàn)

整體傾斜時(shí),根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)

節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動(dòng)

閾值線至高于陰性對(duì)照),重新分析結(jié)果。

5.2結(jié)果判斷

FAM 通道為禽流感病毒 H7N9 亞型 H7 基因檢測結(jié)果,CY5 通道為禽流感病毒

H7N9 亞型 N9 基因檢測結(jié)果

陽性:檢測通道 Ct 值≤35.0,且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線。

可疑:檢測通道 Ct 值>35.0,且出現(xiàn)明顯擴(kuò)增曲線的樣本建議重復(fù)試驗(yàn),重復(fù)試

驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn) Ct 值≤35.0 和明顯擴(kuò)增曲線者為陽性,否則為陰性。

陰性:樣本檢測結(jié)果無 Ct 值且無明顯的擴(kuò)增曲線。

6. 檢測方法的局限性

Ø 樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān);

Ø 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果;

Ø 陽性對(duì)照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏,會(huì)導(dǎo)致假陽性結(jié)果;

Ø 病原體在流行過程中基因突變、重組,會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果;

Ø 不同的提取方法存在提取效率差異,會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果;

Ø 試劑運(yùn)輸,保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降,出現(xiàn)假陰性或定

量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果;

Ø 本檢測結(jié)果僅供參考,如須確診請(qǐng)結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

7. 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品:無明顯擴(kuò)增曲線且無 Ct 值顯示;

陽性質(zhì)控品:擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長期,且 Ct 值≤32;

以上條件應(yīng)同時(shí)滿足,否則實(shí)驗(yàn)視為無效。

【注意事項(xiàng)】

Ø 所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行;

Ø 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化,*混勻并短暫離心;

Ø 反應(yīng)液應(yīng)避光保存;

Ø 反應(yīng)中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊;

Ø 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)工作服;

Ø 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行,以免交叉污染;

Ø 實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器;

Ø 試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待,并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通

則》進(jìn)行處理。

【參考文獻(xiàn)】

[1] Morens D M, Taubenberger J K, Fauci A S. H7N9 avian influenza A virus and the perpetual challenge of potential human pandemicity [J]. MBio,2013, 4(4): e00445-13. [2] 羅思思, 謝芝勛, 劉加波, 等. H7N9 亞型 AIV 雙重實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR 檢測方

法的建立[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2013, 34(12):1-5. [3] 徐曉龍, 包紅梅, 馬 勇, 等. H7 和 N9 亞型及 A 型流感病毒多重?zé)晒?RT-PCR 檢

測方法的建立[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2014, 12, 36: 939-942.

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