高致病禽流感病毒H7亞型HP-H7熒光PCR試劑盒說(shuō)明書
【產(chǎn)品名稱】
商品名稱:高致病性禽流感病毒 H7 亞型(HP-H7)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光-PCR 法)
Name :Highly Pathogenic Avian Influenza Virus subtype H7 Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】48T/盒
【預(yù)期用途】
禽流感是由正粘病毒科流感病毒屬的 A 型流感病毒引起的一種禽類或人類感染的傳染病,分為非致病性、低致病性和高致病性三類[1]。高致病性禽流感是家禽的重要烈性 傳染病,發(fā)病率和病死率可高達(dá) 100%,對(duì)養(yǎng)禽業(yè)危害極大。H7 亞型禽流感因 HA 基因裂解位點(diǎn)的差異表現(xiàn)為高低致病性,及時(shí)檢測(cè) H7 亞型流感致病性具有重要意義。
本試劑盒利用實(shí)時(shí)熒光 PCR 原理,檢測(cè)高致病 H7 亞型禽流感病毒,對(duì)高致病H7 亞型禽流感引起的流感的診斷有重要指導(dǎo)意義。
【檢驗(yàn)原理】
本試劑盒根據(jù)高致病性H7 亞型禽流感HA 基因裂解位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物和探針, 在反應(yīng)體系中含高致病H7 亞型禽流感病毒基因組模板的情況下,PCR 反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號(hào)。利用儀器對(duì) PCR 過(guò)程中相應(yīng)通道的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和輸出, 實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的定性、定量分析。
【試劑組成】
名 稱 | 規(guī) 格 |
酶液 | 50μL×1 管 |
HP-H7 反應(yīng)液 | 1.0mL×1 管 |
HP-H7 陽(yáng)性質(zhì)控品 | 50μL×1 管 |
陰性質(zhì)控品 | 250μL×1 管 |
注:
1) 不同批號(hào)試劑不能混用。
2) 試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標(biāo)示的檢測(cè)次數(shù)。
【儲(chǔ)存條件及有效期】
-20℃±5℃,避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過(guò) 5 次,有效期 12 個(gè)月。
【適用儀器】
ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測(cè)儀。
【標(biāo)本采集】
病死或撲殺禽,取喉氣管、腦、胸肌、心肌和肺等組織;待檢活禽,用棉拭子取呼吸道分泌物或排泄物,置于 1mL 50%甘油生理鹽水中。
【保存和運(yùn)輸】
上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃,長(zhǎng)期保存可置-70℃,但不能超過(guò) 6 個(gè)月,標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運(yùn)輸,嚴(yán)禁反復(fù)凍融。
【使用方法】
1. 樣品處理(樣本處理區(qū))
1.1 樣本前處理
每份組織分別從 3 個(gè)不同的位置稱取樣品約 1g,手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨,加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨,待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中,8000rpm 離心 2min,取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中;棉拭子直接取 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中。
1.2 RNA 提取
推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的RNA 提取試劑盒(離心柱提取法),請(qǐng)按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。
2. 試劑配制(試劑準(zhǔn)備區(qū))
根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù),設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽(yáng)性對(duì)照;樣品每滿7 份,多配制 1 份),每測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表:
試劑 | HP-H7 反應(yīng)液 | 酶液 |
用量 | 20μL | 1μL |
將混合好的測(cè)試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中,21uL/管。
3. 加樣(樣本處理區(qū))
將步驟 1 提取的 RNA、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL,分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中,蓋好管蓋,混勻,短暫離心。
4. PCR 擴(kuò)增(核酸擴(kuò)增區(qū))
4.1 將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi);
4.2 設(shè)置好通道、樣品信息,反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL;熒光通道選擇:
檢測(cè)通道(Reporter Dye)FAM, 淬滅通道(Quencher Dye)NONE,ABI 系列儀器請(qǐng)勿選擇ROX 參比熒光,選擇 None 即可。
4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置:
步驟 | 循環(huán)數(shù) | 溫度 | 時(shí)間 | 收集熒光信號(hào) |
1 | 1 cycle | 42℃ | 20min | 否 |
2 | 1 cycle | 95℃ | 10min | 否 |
3 | 40 cycles | 94℃ | 15sec | 否 |
55℃ | 30sec | 是 |
5. 結(jié)果分析判定
5.1 結(jié)果分析條件設(shè)定
設(shè)置 Baseline 和 Threshold:一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析,當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時(shí),根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、
stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動(dòng)閾值線至高于陰性對(duì)照),重新分析結(jié)果。
5.2 結(jié)果判斷
陽(yáng)性:檢測(cè)通道 Ct 值≤35.0,且曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)曲線。
可疑:檢測(cè)通道 Ct 值>35.0,且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線的樣本建議重復(fù)試驗(yàn),重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn) Ct 值≤35.0和明顯擴(kuò)增曲線者為陽(yáng)性,否則為陰性。
陰性:樣本檢測(cè)結(jié)果無(wú) Ct 值且無(wú)明顯的擴(kuò)增曲線。
6. 檢測(cè)方法的局限性
Ø 樣本檢測(cè)結(jié)果不樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān);
Ø 樣本提取過(guò)程中沒有控制好交叉污染,會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果;
Ø 陽(yáng)性對(duì)照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏,會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果;
Ø 病原體在流行過(guò)程中基因突變、重組,會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果;
Ø 不同的提取方法存在提取效率差異,會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果;
Ø 試劑運(yùn)輸,保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測(cè)效能下降,出現(xiàn)假陰性或定量檢測(cè)不準(zhǔn)確的結(jié)果。
7. 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
陰性質(zhì)控品:無(wú)明顯擴(kuò)增曲線且無(wú) Ct 值顯示;
陽(yáng)性質(zhì)控品:擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長(zhǎng)期,且 Ct 值≤32; 以上條件應(yīng)同時(shí)滿足,否則實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。
【注意事項(xiàng)】
Ø 所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行;
Ø 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化,*混勻并短暫離心;
Ø 反應(yīng)液應(yīng)避光保存;
Ø 反應(yīng)中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊;
Ø 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)與用工作服;
Ø 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行,以免交叉污染;
Ø 實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器;
Ø 試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待,并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。
【參考文獻(xiàn)】
【生產(chǎn)企業(yè)】
企業(yè)名稱:上海烜雅生物科技有限公司
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