熒光定量PCR是一種分子生物學技術，用于檢測DNA或RNA樣本中的特定序列。這種技術通過在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化。
一、原理
這是一種以熒光信號為基礎的PCR技術，它是利用熒光染料標記的靶分子在PCR反應過程中的特異性擴增，實現(xiàn)DNA分子定量分析的一種方法。
熒光定量PCR分為兩種方法：染料法和探針法。是一種結(jié)合雙鏈DNA的染料，它在PCR反應過程中結(jié)合到擴增產(chǎn)物中，產(chǎn)生特異性熒光信號，從而實現(xiàn)實時監(jiān)測PCR反應的熒光定量。探針法是利用特殊的探針標記目標序列，這種探針在熒光棒上加有熒光基團，只有在PCR反應的溫度高于探針的脫離溫度時，才能與目標序列特異性雜交并釋放熒光信號，其子類包括TaqMan探針、分子信標探針和通量探針等。
二、技術方法
1.樣本的制備
需要進行精細樣品制備，樣品制備方式與檢測目的密切相關。例如，如果是檢測基因的表達水平，需要提取RNA進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，如果要檢測特定DNA序列，可以用PCR擴增獲取擴增產(chǎn)物，并進行目標序列的純化或酶切等操作。
2.PCR反應體系的制備
PCR反應體系的制備需要注意靈敏度和特異性，并且需要進行良好的優(yōu)化。體系包括模板、引物、酶和緩沖液等。引物是qPCR的關鍵部分，它必須能夠牢固地結(jié)合到樣品DNA上，擴增出特定的擴增產(chǎn)物。緩沖液用于維持PCR反應體系的pH和離子強度，酶則是擴增產(chǎn)物的生成催化劑。
3.PCR反應過程
PCR反應過程分為三個階段：變性、退火和延伸。擴增參數(shù)如溫度和時間等會影響PCR效率和特異性，溫度和時間要根據(jù)反應體系優(yōu)化。
4.數(shù)據(jù)分析和結(jié)果的解釋
結(jié)果需要通過熒光曲線得到，并在以標準曲線為基礎的測量下，通過一系列的基因表達分析軟件進行分析。
三、技術應用
1.基因表達分析
可以用于基因表達與調(diào)控研究，利用該技術可以實現(xiàn)不同時間點或不同處理條件下目標基因的表達量的定量測量，進而探究基因的功能和調(diào)控機理，以及生物發(fā)育、疾病診斷等領域中的應用。
2.微生物檢測
可以在不需要生長或培養(yǎng)微生物的情況下，通過在其核酸序列上進行PCR反應和熒光定量來檢測微生物的存在和含量。這種方法比傳統(tǒng)培養(yǎng)法更快、更靈敏和更準確。
3.進化研究
可以用于研究特定DNA序列的變異和多態(tài)性，并確定DNA序列的起源和進化方向。該技術廣泛應用于生物系統(tǒng)進化、物種鑒定和親緣關系等領域中。
4.腫瘤診斷
可以用于診斷某些腫瘤的存在和發(fā)展。比如可以在患者血液、組織和體液等樣品中檢測癌細胞的DNA或RNA，在早期檢測和治療方面有重要的臨床價值。
四、注意事項
1.PCR反應體系的優(yōu)化和標準化
PCR反應體系的優(yōu)化和標準化對于結(jié)果的準確性和可重復性十分重要。需要根據(jù)反應目的和所需的特定樣品的特征對PCR反應體系進行優(yōu)化。
2.選擇合適的引物和熒光探針
引物的設計應該充分考慮基因序列的一些特異性區(qū)域，特別是SNP和Indel的分布，避免出現(xiàn)位點失配。而熒光探針的類型應該根據(jù)技術的目的和反應特點進行選擇。
3.樣品的制備和保存
樣品制備和保存的方式應該依據(jù)不同實驗目的而定。特別要注意的是，樣品在制備和保存過程中避免受到污染和退化。
4.充分掌握數(shù)據(jù)分析和結(jié)果解讀的技巧和方法
結(jié)果不能僅僅從熒光曲線和計數(shù)得到，還需要進行基因表達、SNP分析和組織分析等一系列的統(tǒng)計學分析。需要充分掌握數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計技巧。
總之，qPCR技術已成為生命科學、醫(yī)學和農(nóng)業(yè)等領域中DNA、RNA檢測和定量的主要手段之一，更加便捷、靈敏、準確。但仍需注意技術細節(jié)和數(shù)據(jù)分析，避免出現(xiàn)誤差和失誤。隨著該技術不斷的完善和應用，相信它將更加發(fā)揮其重要性。
